常用的免疫组化染色方法很多，有直接法和间接法。直接法是将酶或荧光素等标记在第一抗体上，然后用该被标记的第一抗体与组织细胞中的抗原结合，即可以显色或在荧光显微镜下观察结果；

间接法是将标记物标记在第二抗体或第三抗体（复合物）上，其方法是先将特异性的第一抗体与组织细胞中相应的抗原结合，再将被标记上标记物的第二抗体与第一抗体结合，最后用显色剂显色或在荧光显微镜下观察结果。

如果标记物是标记在第三抗体（复合物）上，则第二抗体与第一抗体结合后，再用被标记上标记物的第三抗体（复合物）与第二抗体结合，最后用显色剂显色或在荧光显微镜下观察结果。

常用的EPOS一步法属于直接法，EnVision二步法、PAP/APPAP法、LSAB（S-P）法、SABC法、和CSA法等属于间接法。相对来说直接法特异性高，敏感性低，而间接法则敏感性高，特异性低。

过氧化物酶抗过氧化物酶（peroxidaes anti-peroxidaes，PAP）法属于非标记抗体法，该方法的主要技术是通过制备具有高特异性的抗过氧化物酶抗体，并在抗酶抗体中加入过量的过氧化物酶，使过氧化物酶充分结合在抗酶抗体上形成可溶性的PAP复合物。

用于制备PAP复合物时免疫的动物主要是鼠和兔，所以制备出的PAP复合物分别为鼠（mouse）PAP复合物和兔（rabbit）PAP复合物。

PAP法为三步法，除了PAP复合物外，还需要有第二抗体，该第二抗体中的IgG有两个Fab片段，一个与特异性第一抗体结合，另外一个与PAP复合物结合，最后通过PAP复合物上的酶参与显色反应而形成有颜色的不溶性沉淀物。

由于第二抗体中IgG的两个Fab片段是相同的，所以，与之结合的第一抗体和PAP复合物中的抗酶抗体是来源于同源动物。

在检测抗原时要注意抗体的配对，如第一抗体是鼠抗，第二抗体应该为抗鼠的IgG，与鼠PAP复合物结合。同样如果第一抗体是兔抗，第二抗体为抗兔的IgG，与兔PAP复合物结合。如果配对错了，抗体之间就连接不上，染色就失败。

此外，显色剂也要与PAP复合物上的酶相配对，PAP复合物上结合的酶为过氧化物酶，显色底物用DAB或AEC。

 

 

 

 

碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase，APAAP）法也属于非标记抗体法，该方法的主要技术也是通过制备具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体，并在抗酶抗体中加入过量的碱性磷酸酶，使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上形成可溶性的APAAP复合物。

APPAP法的原理、操作步骤等和PAP法基本相同，所不同的是在染色操作过程中不需要用H2O2消除内源性过氧化物酶，所用的显色剂为固蓝、固红或BCIP/NBT等。

 

 

 

 

卵白素-生物素复合物（avidin biotin complex，ABC）法属于亲和免疫组织化学技术，该方法是根据卵白素和生物素具有高度亲和力的生物学特性，用生物素与过氧化物酶结合获得生物素化过氧化物酶，生物素化过氧化物酶再和加入的卵白素形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物即ABC复合物。

ABC法为三步法，第二抗体为生物素化的IgG，其中的Fab片段和第一抗体结合，生物素和ABC复合物中的卵白素结合，最后通过ABC复合物上的过氧化物酶参与显色反应而形成有颜色的不溶性沉淀物。由于卵白素和生物素的亲和力极强，所以ABC法较敏感，比PAP法敏感20～40倍。

 

 

 

 

标记抗生物素蛋白链菌素-生物素（lablled streptavidinbiotin）法和ABC法相似，不同处是在第二抗体之后ABC法用ABC复合物而LSAB法用标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链菌素（streptavidin，SA）。SA是从链霉菌属蛋白分离出来的一种蛋白质，它仅标记了过氧化物酶而本身没有与生物素连接，生物素是连接在第二抗体上。

由于SA分子量较小，ABC复合物分子量大，因而SA穿透组织的能力比ABC复合物大，反应速度快。SA有两个和生物素亲和力极高的结合点，其本身没有连结生物素，可以与第二抗体上的生物素连结。这样，SA比ABC复合物更容易与第二抗体上的生物素结合，因而SA的敏感性比ABC高，反应所需的时间比ABC短。

 

 

 

 

以上就是前四种种常用的免疫组织化学染色方法的简介。如在实验中遇到困难，也可以选择Leica全自动免疫组化染色仪来协助您。